13. 细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 - 10 %DMSO (dimethyl

sulfoxide) 和 90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO

稀释时会放出大量热能， 故不可将 DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完

成。

14. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保存使用之 DMSO 等级， 必须为 Tissue culture grade 之 DMSO (如 Sigma

D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存

于 4°C， 避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机

会。若要过滤 DMSO， 则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜。

15. 冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一: 冷冻管置于 4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80

℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 ℃ 至

–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。*-20 ℃不可超过 1 小时， 以

防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活

率稍微降低一些。

16. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml

vial 为宜。

17. 应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为

无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作

技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

18. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。 % h7 K+ d* K' K, J

19. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分

辨之。

20. 支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实

验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

21. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

22. 为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且 pH 值会越来越偏碱性？

培养基保存于 4 ℃ 冰箱中， 培养基内之 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏

碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为 phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗

红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入

无菌过滤之 CO2， 以调整 pH 值。

23. 各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？

不同厂牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同，

虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask

而有显著之生长差异。 ) Z, r* D" X+ X' W/ p' ~

24. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的

失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应

待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。